neuroWAS: studiare la Sindrome di Wiskott-Aldrich per comprendere le sue conseguenze sul neurosviluppo

Un progetto dell’Istituto Mario Negri sostenuto da LaSpes

Si chiama Neurowas, il programma triennale che LaSpes Onlus e l’ IRCC, Istituto Mario Negri hanno lanciato per finanziare un progetto di ricerca, particolarmente avanzato, che ha lo scopo di indagare le manifestazioni neurologiche della Sindrome Wiskott Aldrich (WAS).

Responsabile del progetto è il dottor Stefano Fumagalli, che sarà coadiuvato da una giovane ricercatrice, assegnataria di una Borsa di studio messa a disposizione da LaSpes. Il Programma è stato avviato con l’approvazione del professor Silvio Garattini e dopo una attenta valutazione da parte del Prof Aiuti del Comitato Scientifico della Associazione.

Dettagli e descrizione del progetto:

La Sindrome di Wiskott-Aldrich, conosciuta anche come WAS, è una rara malattia genetica legata al cromosoma X. È causata da mutazioni nel gene WAS, responsabile della produzione della proteina WASp, un regolatore fondamentale dello sviluppo e del funzionamento delle cellule del sistema immunitario.

Si tratta di una immunodeficienza congenita complessa, caratterizzata da una maggiore predisposizione a infezioni batteriche, virali e fungine, spesso ricorrenti e potenzialmente gravi. La WAS colpisce prevalentemente i maschi e, secondo le stime, ha un’incidenza di circa 5-10 casi ogni milione di nati vivi nel mondo.

Tradizionalmente la malattia viene diagnosticata nei primi anni di vita, ma dati recenti suggeriscono che alcune forme possano essere riconosciute anche in età adulta, in particolare nelle donne, con un’età mediana alla diagnosi di circa 32 anni.

Oltre il sistema immunitario: il possibile impatto sul cervello

Sebbene la WAS sia nota soprattutto per le sue manifestazioni immunologiche, la malattia può essere associata anche a complicanze neurologiche.

Tra queste possono rientrare sanguinamenti o infezioni cerebrali acute, ritardi nello sviluppo, crisi epilettiche e alterazioni del comportamento. Queste manifestazioni possono incidere in modo significativo sulla qualità della vita dei pazienti.

I meccanismi alla base delle complicanze neurologiche della Sindrome di Wiskott-Aldrich non sono ancora pienamente compresi. È proprio su questo aspetto che si concentra il progetto neuroWAS.

Il ruolo della microglia

Le analisi di dati di sequenziamento a singola cellula disponibili in database pubblici indicano che, nel cervello, la microglia esprime livelli particolarmente elevati del gene WAS.

La microglia è una popolazione di cellule immunitarie residenti nel sistema nervoso centrale. Svolge un ruolo essenziale nel mantenimento dell’equilibrio del cervello e partecipa ai processi di neurosviluppo, contribuendo alla formazione e alla regolazione delle reti neuronali.

L’ipotesi alla base del progetto è che la proteina WASp sia necessaria per le funzioni neurosviluppali della microglia. Quando WASp è alterata da mutazioni genetiche, le cellule mieloidi del cervello potrebbero funzionare in modo anomalo, influenzando i processi fisiologici che avvengono nelle prime fasi della formazione delle reti cerebrali.

In età adulta, una microglia difettosa potrebbe inoltre contribuire agli eventi neuroinfiammatori osservati in alcuni soggetti con WAS.

Perché studiare le forme lievi della malattia

Il progetto si concentra su specifiche mutazioni patogeniche osservate in pazienti con forme considerate lievi di Sindrome di Wiskott-Aldrich.

Recentemente, alcune varianti genetiche sono state classificate in base alla severità clinica. Le cosiddette varianti di classe I corrispondono a punteggi WAS pari a 1 o 2 e sono associate a un fenotipo più lieve. Al contrario, le varianti di classe II corrispondono a punteggi più elevati e a forme più severe della malattia.

I pazienti con punteggio WAS 1 o 2 sono spesso classificati come affetti da trombocitopenia X-linked e non sempre vengono considerati candidati immediati per terapie curative. Tuttavia, questo può diventare problematico se, nel tempo, sviluppano complicanze potenzialmente gravi, soprattutto quando un eventuale danno d’organo permanente rende più rischiose o meno efficaci le opzioni terapeutiche disponibili.

Per questo motivo, anticipare e comprendere le possibili conseguenze neurologiche anche nelle forme lievi della WAS rappresenta un obiettivo importante.

Gli obiettivi del progetto neuroWAS

Il progetto neuroWAS mira a definire in che modo alterazioni della proteina WASp possano influenzare il normale sviluppo e funzionamento del cervello.

In particolare, il progetto si propone di:

1. ottenere microglia derivata da cellule staminali pluripotenti indotte umane, portatrice di sei diverse mutazioni missenso localizzate negli esoni 1 e 2 del gene WAS;
2. definire in che modo le varianti WAS di classe I alterino le funzioni neurosviluppali della microglia;
3. ottenere embrioni di zebrafish mutati, privi del gene WAS;
4. studiare l’impatto della perdita del gene WAS sul neurosviluppo e sul comportamento dello zebrafish.

Il disegno della ricerca

Il progetto è articolato in quattro pacchetti di lavoro, o Work Packages.

WP1 — Modellizzazione delle varianti patogeniche di classe I nella microglia

I ricercatori genereranno microglia mutata in modo da riprodurre le varianti patogeniche di classe I della Sindrome di Wiskott-Aldrich.

Queste cellule saranno poi analizzate per studiare funzioni chiave potenzialmente modulate da WASp, come l’organizzazione del citoscheletro e il comportamento fagocitico.

WP2 — Analisi delle funzioni fisiologiche della microglia mutata

La microglia derivata da cellule staminali pluripotenti indotte umane sarà studiata per valutare:

• l’assemblaggio del citoscheletro;
• la motilità cellulare;
• l’attività fagocitica;
• l’espressione di marcatori funzionali della microglia.

Successivamente saranno generati organoidi corticali umani, cioè modelli tridimensionali in vitro della corteccia cerebrale. La microglia matura sarà integrata in questi organoidi per studiare se le mutazioni di WAS alterano la capacità della microglia di interagire con le sinapsi.

WP3 — Impatto della delezione del gene WAS sul neurosviluppo dello zebrafish

Il progetto prevede anche la generazione di embrioni di zebrafish privi del gene WAS.

Questo modello in vivo permetterà di studiare l’impatto della mutazione sul neurosviluppo attraverso tecniche di immunofluorescenza e microscopia confocale. Le conseguenze funzionali della perdita di WASp saranno inoltre valutate tramite test comportamentali specifici, come il test di risposta al tatto.

WP4 — Disseminazione dei risultati

I risultati principali della ricerca saranno condivisi sia con la comunità scientifica sia con il pubblico non specialista.

La disseminazione rappresenta una parte importante del progetto, perché contribuisce ad aumentare la conoscenza della Sindrome di Wiskott-Aldrich e delle sue possibili conseguenze neurologiche.

Le metodologie utilizzate

Il progetto utilizzerà due linee di cellule staminali pluripotenti indotte umane non differenziate, che saranno mutate attraverso la tecnica CRISPR-Cas9 per riprodurre specifiche mutazioni missenso associate alle varianti patogeniche di classe I della WAS.

Le cellule mutate saranno poi sottoposte a un protocollo di differenziamento di 47 giorni per ottenere microglia matura.

La microglia così generata sarà analizzata attraverso diverse metodologie avanzate, tra cui:

• microscopia a super-risoluzione per studiare l’assemblaggio del citoscheletro;
• microscopia confocale time-lapse per osservare motilità e attività fagocitica;
• RT-PCR quantitativa per valutare l’espressione di marcatori funzionali;
• organoidi corticali umani per studiare il pruning sinaptico della microglia in un modello tridimensionale della corteccia cerebrale;
• modelli di zebrafish per analizzare alterazioni del neurosviluppo e del comportamento.

Perché questa ricerca è importante

La severità, l’età di insorgenza e la manifestazione clinica della Sindrome di Wiskott-Aldrich possono variare molto da paziente a paziente, anche all’interno della stessa famiglia.

Questa variabilità rende la WAS una condizione genetica complessa, difficile da gestire e da trattare. Le terapie disponibili includono il trapianto di cellule staminali ematopoietiche, la terapia genica, trattamenti antimicrobici, immunoglobuline, splenectomia e agenti trombopoietici.

Tuttavia, le terapie non sono sempre efficaci e i pazienti possono andare incontro a complicanze gravi. Questo è particolarmente rilevante per le conseguenze neurologiche della WAS, che possono manifestarsi anni dopo la nascita e che, al momento della diagnosi iniziale, possono non essere rilevate per mancanza di strumenti in grado di anticiparle.

Inoltre, trattamenti come il trapianto di cellule staminali ematopoietiche o la terapia genica non sono necessariamente in grado di correggere i difetti della microglia. Queste cellule, infatti, hanno origine mieloide e si insediano nel sistema nervoso centrale durante l’embriogenesi, mantenendo poi un ricambio limitato nel corso della vita.

I risultati attesi

Se il progetto riuscirà a identificare le conseguenze delle mutazioni di WASp nella microglia, potrà contribuire a due importanti obiettivi.

Il primo è l’identificazione di nuovi bersagli terapeutici per limitare le conseguenze neurologiche della Sindrome di Wiskott-Aldrich.

Il secondo è la definizione di una nuova metodologia per studiare specifiche mutazioni del gene WAS nei pazienti, con l’obiettivo di anticipare possibili complicanze neurologiche prima della comparsa dei sintomi.

In questo senso, neuroWAS non è solo un progetto di ricerca sul funzionamento di una rara malattia genetica. È anche un passo verso una medicina più predittiva, capace di riconoscere prima i rischi, comprendere meglio i meccanismi biologici e aprire nuove possibilità di cura.

Una ricerca rara, ma necessaria

Le malattie rare sono spesso invisibili, ma esistono. E proprio perché coinvolgono poche persone, hanno bisogno di ricerca, attenzione e strumenti capaci di renderle più comprensibili.

Il progetto neuroWAS dell’Istituto Mario Negri, sostenuto da LaSpes, nasce con questo obiettivo: studiare una malattia rara andando oltre i sintomi più noti, per capire cosa accade nel cervello, nella microglia e nei processi di neurosviluppo.

Perché comprendere meglio la Sindrome di Wiskott-Aldrich significa dare nuove possibilità ai pazienti, alle famiglie e alla comunità scientifica.